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限制性內(nèi)切酶: 使用前需要考慮的五件事

  • 發(fā)布日期:2019-10-24      瀏覽次數(shù):1042
    •    限制性內(nèi)切酶: 使用前需要考慮的五件事
        自20世紀70年代以來,使用限制酶來表征DNA的方法一直很受歡迎。如今,這種技術仍然是評估DNA序列簡單、快速的方法之一。與大多數(shù)實驗室試劑一樣,限制性內(nèi)切酶可能是變化無常的。無論你是簡單地消化一個質粒,還是執(zhí)行復雜的克隆或篩選程序,都需要考慮幾個主要的因素:
        正確的使用條件
        每一種酶都是不同的,需要特定的條件,例如:
        BSA是許多限制性酶的穩(wěn)定劑;有些酶不能長時間工作超過1-2個小時
        大多數(shù)限制性酶在pH 7.2和pH 8.5之間有效地消化,使用合適的緩沖液很重要。
        大多數(shù)商業(yè)供應商都有他們自己選擇和使用限制性內(nèi)切酶的特別指南,使用前應了解清楚。
        在雙重限制性酶消化時,如果兩種酶的佳條件不同,你可能需要部分地犧牲一種酶的活性。在分析結果時要考慮這一點?;蛘撸梢赃M行連續(xù)的消化,先使用種酶,凝膠提取去除緩沖液組分,然后用第二種酶消化。如果使用這種方法,開始用多個管子進行相同反應可能是明智的,因為在凝膠提取過程中,可能會丟失很多材料。
        甲基化作用
        當細菌復制一個質粒時,它們通常將特定的CpG島甲基化。這些序列通常是甲基化的目標。 限制性酶切位點也可能由于與甲基化位點有重疊而無法切割。此時,限制性內(nèi)切酶位點與旁側的序列恰巧組成Dam或者Dcm識別位點,并進而被甲基化而阻斷切割。因此在質粒構建設計酶切位點時,要充分考慮到這種情況。
        在實驗室大腸桿菌菌株中有三種不同類型的甲基化酶: Dam甲基化酶、Dcm甲基轉移酶和EcoKI甲基化酶。如果你想要消化一個可能被甲基化的限制位點,你可以使用一個甲基化無能力的大腸桿菌菌株(JM11)來繁殖你的質粒。這些大腸桿菌菌株無法甲基化DNA,從而你的限制性酶可以裂解CpG島。
        星活性小化
        一些限制酶在特定的條件下,它們可能會變得雜亂,隨機消化DNA,而不是在特定的識別位點。這種現(xiàn)象被稱為星活性,通常是由長時間的潛伏期或緩沖條件不佳(如pH)引起的。因此,使用所需的酶與推薦的緩沖液是至關重要的。
        此外,高甘油濃度可能會導致星活性增加。由于大多數(shù)酶和它們的緩沖液都被包裝成甘油來延長保質期,所以你應該充分稀釋緩沖液和酶。這也是為什么許多公司在他們的通用步驟建議20 - 50?l反應體系和提供10 x緩沖液。
        給你的酶一些空間
        某些酶在識別位點兩邊有幾個堿基對時效率高。如果你要用雙切,兩種酶位置比較緊密,或者消化PCR產(chǎn)物的末端時,這一點尤其重要。
        每個制造商對他們的產(chǎn)品都有具體的建議,但通常建議確保在識別位點的兩邊至少有6個堿基對。添加更多堿基對的簡單方法是通過PCR引物進行設計。盡量避免帶有引物二聚體形成風險的序列。
        同裂酶和異裂酶
        有時你需要使用一種特殊的酶,它的條件并不適合你的實驗設置。在這種情況下,同裂酶可能會幫助你進行你的實驗,而不會嚴重影響你的終結果。
        同裂酶是兩種能識別相同的位點,但具有不同性質的限制性酶,通常來自不同的細菌體系。例如,SinI 和AvaII 都都識別序列G / G(A或T)CC。然而,AvaII是甲基化敏感的,而SinI不是。因此,如果你想要切斷這個序列,并且不想使用甲基化不敏感的大腸桿菌菌株,那么SinI可以滿足條件,而AvaII則不會。
        兩種酶具有相同的識別位點,但在不同的堿基對上切割被稱為異裂酶。這可能有助于避免星活性和甲基化敏感性。例如, KpnI和Acc65I都識別這個位點:GGTACC,但在不同的位置切割。KpnI切割bp 5:GGTAC / C,而Acc65I切割bp 1:G / GTACC。KpnI可能會顯示出星活性,而Acc65I則更強健。因此,如果切割位置不重要,Acc65I可能是一個更好的選擇。

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