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Clodronateliposomes氯磷酸-脂質(zhì)體介紹及使用

  • 發(fā)布日期:2018-01-04      瀏覽次數(shù):4165
    • Clodronaiposomes氯磷酸-脂質(zhì)體介紹及使用

      中文名:體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除

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      Clodronate Liposomes體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除

        去除巨噬細(xì)胞(depletion of macrophages)是研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije UniversityNico van Rooijen教授開(kāi)發(fā)的一款Clodronate Liposomes,可以利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制,將膜不通透性的氯磷酸(clodronate)帶入細(xì)胞內(nèi),從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的。

         

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        作用原理:

        兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體,磷脂雙分子層中間通過(guò)水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過(guò)程中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中(如圖1)。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過(guò)脂質(zhì)體的磷脂雙分子層。隨著脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬,在巨噬細(xì)胞溶酶體磷酸酶的作用下,溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來(lái),并累積在細(xì)胞內(nèi),當(dāng)其達(dá)到一定濃度時(shí),巨噬細(xì)胞將會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷,從而進(jìn)入凋亡過(guò)程(如圖2)。從死亡的巨噬細(xì)胞中釋放出來(lái)的氯磷酸鹽在細(xì)胞外的半衰期極短(大約15min),可以通過(guò)泌尿系統(tǒng)排除體外。

        1氯磷酸-脂質(zhì)體Clodronate liposomes復(fù)合物。在脂質(zhì)體的形成過(guò)程中氯磷酸通過(guò)溶解在水溶液中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中。

        2巨噬細(xì)胞清除原理。包裹著氯磷酸(方塊)的脂質(zhì)體通過(guò)巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,與溶酶體(L)融合后,在磷脂酶(箭頭)的作用下,釋放出氯磷酸,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氯磷酸的濃度達(dá)到一定濃度,就會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損害,從而迫使其進(jìn)入細(xì)胞凋亡。

        產(chǎn)品性質(zhì):

        1ml脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4,10 mM NaH2PO4,140 mM NaCl。

        脂質(zhì)體體內(nèi)注射:

        隔日尾靜脈注射200μl clodronate liposome,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制定注射日程。通過(guò)免疫組化或流式檢測(cè)巨噬細(xì)胞去除效率。

        尾靜脈注射方法:

        1)將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi),從孔口拉出尾巴,小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈,2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布,一般采用左右兩側(cè)的靜脈;

        2)將紗布浸泡于約70度的溫水中,拿出后包裹尾巴,以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的;

        3)行尾部靜脈注射時(shí),以左手拇指和食指前后摁住鼠尾,留出約2cm一段,使皮膚緊張,靜脈更為充盈,右手持1ml針頭注射器,使針頭與靜脈平行(小于30°),從尾巴的下1/4處進(jìn)針,開(kāi)始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢,仔細(xì)觀察,如果無(wú)阻力,無(wú)白色皮丘出現(xiàn),說(shuō)明已刺入血管,可正式注入藥物。

        4)有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥,注射部位應(yīng)盡可能從尾端開(kāi)始,按次序向尾根部移動(dòng),更換血管位置注射給藥。拔出針頭后,用棉球按住注射部位輕壓1-2min,止血。

        效果展示:

        案例一:

         案例二:

         

        左圖顯示的是正常脾臟細(xì)胞中陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的染色結(jié)果。右圖為clodronate-liposome注射2天后觀察的結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)只剩下少量的巨噬細(xì)胞。 左圖表示正常肝臟細(xì)胞中陽(yáng)性的Kupffer細(xì)胞。右圖表示clodronate-liposomes注射2天后,肝臟Kupffer細(xì)胞染色結(jié)果,Kupffer細(xì)胞基本被清除。

         

        FAQ:

        Q:收到Clodronate liposomes后該如何操作?

        A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后,如果不能馬上使用,需要放置在4℃冰箱。禁止凍存!使用時(shí)作為原液使用,不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀,建議使用之前輕輕混勻,另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用,需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射。

        Q: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除?

        A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除,但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。主要是由于在體外培養(yǎng)過(guò)程中,從死亡細(xì)胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中滲漏出來(lái)氯磷酸,會(huì)一直存在于培養(yǎng)基中,但是在體內(nèi),氯磷酸的半衰期很短,很快就會(huì)被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞也不會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體,但是一旦他們?cè)谂囵B(yǎng)基中積累就會(huì)慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中。

        Q:在靜脈注射Clodronate liposomes后動(dòng)物很快就死亡了,是什么原因?

        A:一方面有可能是動(dòng)物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生沉降。如果在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)需要一次注射多只動(dòng)物,那么脂質(zhì)體便會(huì)在注射器中發(fā)生沉淀,形成不均一懸液,這樣一來(lái),*只注射的計(jì)量與zui后一只注射的計(jì)量就會(huì)發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后,沒(méi)有恢復(fù)到室溫。

        Q:動(dòng)物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了?

        A:這個(gè)可能是受到細(xì)菌的污染,體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會(huì)增加例如病毒粒子,細(xì)菌或者酵母感染的幾率。

        Q:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒(méi)有*消失?

        A:大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1ED2雙陽(yáng)性,但是有一些沒(méi)有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+,但是呈現(xiàn)ED2-。因此,所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除,但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除,清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例。

        Q: Clodronate liposomes沒(méi)有達(dá)到期望的效果?

        A:氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn),每批次都會(huì)對(duì)氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測(cè),確保無(wú)誤后才會(huì)銷售給客戶。另外,脂質(zhì)體容易收到溫度的影響。正確的運(yùn)輸和儲(chǔ)存方式是4~8℃,懸液既不能被凍存,也不能被加熱超過(guò)30℃。自收到貨物起,需要在3個(gè)月內(nèi)使用完,不然有可能會(huì)影響使用的效果。

        Q:在靜脈注射時(shí),能不能增加注射的體積?

        A:靜脈注射時(shí)需要依據(jù)動(dòng)物的體重,不能超過(guò)0.1ml/10mg,但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定。

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